免疫球蛋白的分離提取：

 

　　1．鹽析法（Saltfractionation）：蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中相對(duì)溶解度不同。血清γ球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀，而白蛋白則不易沉淀，據(jù)此可將二者分離。其方法步驟如下：

 

    （1）配制飽和硫酸銨溶液：取500ml蒸餾水加熱至70~80℃，將400g硫酸銨溶于其中，攪拌20分鐘，冷卻。待硫酸銨結(jié)晶沉于瓶底，其上清即為飽和硫酸銨。在使用前用28%氨水調(diào)pH為7.0。　

 

　　（2）用50%飽和硫酸銨提取血清中β、γ球蛋白：血清一份加生理鹽水一份混勻，然后逐滴加入飽和硫酸銨二份中，邊加邊攪拌，防止形成團(tuán)塊降低沉淀物的特異性。混勻后靜置30分鐘或置4℃冰箱過(guò)夜。

 

　　（3）高速低溫離心10000rpm，10分鐘，將上清液（含白蛋白）棄去，取沉淀物（含球蛋白）溶于少量生理鹽水中。

 

　　（4）用33%飽和硫酸銨提取γ球蛋白，方法是將上述提取物生理鹽水溶液兩份加一份飽和硫酸銨。然后再離心10000rpm，其余操作同上。

 

　　（5）按同樣方法用33%飽和硫酸銨再提取一次。

 

　　（6）將提取物裝入透析袋，在生理鹽水中透析，以除去其中所含的硫酸銨。

　　

　　經(jīng)鹽析法提取的蛋白質(zhì)為粗提的免疫球蛋白，若要獲得純化的免疫球蛋白，必須經(jīng)凝膠過(guò)濾或離子交換層析提純。

　　

　　2．凝膠過(guò)濾法（Gelfiltration）：

 

　　利用具有分子篩效應(yīng)的多孔網(wǎng)狀凝膠做為介質(zhì)，可分離提純分子量不同的大分子物質(zhì)。在凝膠過(guò)濾過(guò)程中，分子量大的物質(zhì)因不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙先流出凝膠柱外，分子量小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢而zui后流出柱外，這樣就能將分子量不同的物質(zhì)分離。

　　

　　（1）材料：

 

　　樣品（正常人血清），SephadexG-200，2.5×100mm層析柱，洗脫液（PBS或含NaCl的Tris―HCl緩沖液）。

　　

　　（2）方法：

 

　　①處理凝膠：將SephadexG―200用蒸餾水經(jīng)充分膨脹后進(jìn)行浮選。

 

　　②裝柱：在層析柱底部鋪加一層尼龍紗，然后將洗脫液飽和凝膠粒子沿插入柱底的玻璃棒緩緩傾注于層析柱內(nèi)。

 

　　③加樣：在凝膠柱表面再加一層尼龍紗，沿管壁緩緩加入樣品，所加樣品的體積不超過(guò)凝膠柱的10%。

 

　　④洗脫：洗脫液洗脫，流速20ml/小時(shí)。待樣品洗脫下來(lái)（用20%磺酸水楊素檢測(cè)）既用試管分段收集。

 

　　⑤蛋白測(cè)定：在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定各管樣品的O.D280nm，以判讀各管蛋白含量。

 

　　附：樣品洗脫完畢后，凝膠即已再生。一次裝柱可反復(fù)使用多次。凝膠懸液加防腐劑后于冰箱內(nèi)可保存數(shù)月。

　　

　　（3）結(jié)果分析：正常人血清經(jīng)凝膠過(guò)濾后可分出三個(gè)主要蛋白峰。IgM是在*峰中，和IgM分子量接近的α2―巨球蛋白也在*峰。第二峰主要是IgG，在第二峰開(kāi)始部分含IgA和IgD，第三峰為蛋白和分子量100，000以下的球蛋白。

　　

　　3．離子交換層析法（Ionexchangechromatography）：

 

　　以離子交換劑為介質(zhì)，吸附帶相反電荷的高分子物質(zhì)，由于高分子物質(zhì)的電荷量，等電點(diǎn)不同，用不同離子強(qiáng)度或pH值的洗脫液能置換不同的高分子物質(zhì)。據(jù)此可分離提純免疫球蛋白，是目前zui廣泛應(yīng)用的高分子物質(zhì)提純方法之一。

　　

　　（1）材料：樣品（經(jīng)pH8.0，0.015MPB透析過(guò)的正常人血清，或經(jīng)飽和硫酸銨提取的免疫球蛋白），DEAE―纖維素（陰離子交換劑），2.5×25cm層析柱，及洗脫劑（不同離子強(qiáng)度的PB）。

　　

　　（2）方法：　

　

　　①離子交換劑的預(yù)處理：取適量DEAE―纖維粉劑，用0.5NNaOH除去色素和細(xì)粒，用蒸餾水洗成中性后，再用0.5N的HCl洗滌，zui后用蒸餾水洗成中性并用緩沖液平衡。　

　

　　②裝柱：與凝膠過(guò)濾相同。　

　

　　③加樣：在層析柱頂部留有少量緩沖液時(shí)，既開(kāi)始加樣。在樣品滲入柱內(nèi)液面約留有0.5ml時(shí)，以數(shù)毫升緩沖液沖洗柱壁。然后滴加洗脫劑并調(diào)整流速為1~2ml/分，進(jìn)行洗脫。　

 

　　④洗脫：根據(jù)提取免疫球蛋白種類(lèi)的不同而選擇不同pH及克分子量（molarsolution“M”）。例如提取血清IgG用0.01MpH7.4洗脫，而血清IgA則為1MpH6.4為洗脫液。

 

　　⑤蛋白測(cè)定：同凝膠過(guò)濾法。